​生物医药行业的技术盛会

7月17-19日，由中国药学会主办的“第七届中国药学会生物技术药物质量分析研讨会”盛大召开，来自生物医药及科研领域的多位专家及现场近300位行业人士相聚夏日炎炎的北京，共同探讨生物医药行业内的研究进展及前沿技术。

赛默飞色谱质谱生物制药业务发展经理唐恺带来《基于高分辨质谱平台的宿主细胞残留蛋白（HCPs）检测》的解决方案，助力生物医药行业解决HCPs分析难题。

赛默飞色谱质谱生物制药业务发展经理唐恺

什么是HCPs？为什么需要关注HCPs？

重组蛋白类药物是由遗传修饰的原核或真核宿主细胞培养/发酵产生，由于细胞凋亡/死亡/裂解，其他非必需蛋白质也可能释放到细胞培养基/发酵液中，因此残留在终产品中的其他蛋白质即为宿主细胞残留蛋白（HCPs）。

HCPs的存在会影响药物的安全性和有效性，以及具有蛋白水解活性的HCPs影响药物产品的稳定性，因此生物医药公司不断优化其纯化工艺，从而控制终产品中HCPs的种类和含量。

现有分析方法有哪些不足？

目前ELISA方法因其高灵敏度、高通量和易操作优势成为工业界的金标准，但仍存在很多限制。包括：

1.不能对HCPs进行精准鉴定，低丰度HCPs的检测易受限于高丰度蛋白的干扰；

2.定量动态范围（3个数量级）较低，抗体受限，开发周期长；

3.无法改变已有的方法，缺少校正标准限制定量的准确性，因此需多种检测方法相结合。

高分辨质谱技术的优势

随着高分辨质谱技术性能的不断提升，已具有高灵敏度和宽的定量动态范围，以及蛋白质组学技术的飞速发展，可实现对未知蛋白质的高通量定性和定量。

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组合型四极杆Orbitrap质谱仪

基于nanoLC-MS/MS高灵敏平台的方法，如何对HCPs进行准确定性和相对定量呢？

一、样品前处理

2017年礼来制药公司Huang, Lihua, et al.在Analytical Chemistry杂志上发表中的方法是，以NIST抗体标准品为例，在蛋白质非变性的条件下进行酶切，抗体主成分被部分酶切，酶切后经90度高温变性，未被酶切的部分将被沉淀去除，从而提高HCPs的鉴定几率和方法的动态范围。

我们在此基础上进一步优化，缩短前处理时间提高工作效率，同时为考察此套流程对1-100ppm的HCPs的鉴定和相对定量能力，加入内标蛋白UPS2（48种蛋白，6个不同浓度）进行定性和相对定量。

图1.样品前处理流程示意图（来自Huang, Lihua, et al.）

二、仪器、色谱柱、数据分析软件

目前根据液相色谱的流速可分为纳升液相色谱（nanoLC,<1μL/min）、毛细管液相色谱（capillaryLC,1-1μL/min）、微流速液相色谱（microLC,10-100μL/min）、分析流速液相色谱（LC,>100μL/min），由于样品单位浓度和离子化效率依次下降，因此其灵敏度逐渐下降，本次实验采用灵敏度最高的纳升液相系统。

三、实验结果

1.定性结果：

内标蛋白UPS2中含有48种内标蛋白6个不同浓度，共鉴定其中24种，其实际含量结果如表1，含量范围为0.05-444.88ppm，实际含量>1ng（10ppm）的16种内标蛋白全部鉴定到，实际含量在0.06-0.38ng（0.6-3.8ppm）范围内共鉴定到6种，此方案的灵敏度足以满足生物药领域客户的需求。

（详细结果请见文末AN下载）

表1.本次实验中鉴定到UPS2内标蛋白的种类及其实际含量

2.蛋白相对定量结果：

本次实验进行HCPs的相对定量，采用蛋白TOP3的特异性肽段峰面积的平均值算法，得出每种蛋白的峰面积，经过三次技术重复，对特异性肽段大于等于1的蛋白峰面积进行统计，平均峰面积分布如图3A，峰面积大于1e⁸的蛋白为此样品的主抗体，可看出本实验定量范围达6个数量级。UPS2内标蛋白的峰面积与绝对含量的分布如图3B，峰面积与绝对含量存在一定的线性关系， HCPs的相对含量可根据其峰面积进行初步判断，进而优化纯化工艺。

图3A.特异性肽段大于等于1的蛋白峰面积分布图

图3B.内标蛋白UPS2的峰面积（log2）与其绝对含量的分布

基于UHPLC-MS/MS平台的方法：

UHPLC-MS/MS对于低含量HCPs的检测时，需提高上样量（至少是纳升液相系统的50倍）以提高其灵敏度。

经实例验证此方法同样满足当前大部分需求，某抗体药物的HCPs经ELISA定量为5ppm，UHPLC-MS/MS能够准确鉴定到6种HCPs（unique peptides≥2）,通过内标UPS2确定其检测限达1ppm，6种HCPs的相对含量在1-10ppm内。

小结

随着蛋白质组学的飞速发展，赛默飞Orbitrap高分辨质谱，可采用纳升液相，超高效液相两种方式，定性和相对定量分析HCPs，LOD均低至1ppm以下，为传统的ELISA方法补充更为丰富的信息，进一步帮助生物医药企业优化纯化工艺，监控终产品和过程产物中的HCPs含量。

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