题目：Label-free Quantitative Analysis of Protein Expression Alterations in miR-26a-Knockout HeLa Cells using SWATH-MS Technology
SWATH-MS定量蛋白质组学研究miR-26a敲除HeLa细胞蛋白表达谱
期刊：Scientific Reports
影响因子：4.122
主要技术：SWATH-MS
研究背景
微小RNA（miRNA）能够以序列特异性方式结合靶mRNA的3'非翻译区，随后抑制基因翻译。人类miR-26a在基因水平上的研究较多，且其众多功能已揭示，但是靶基因的蛋白质水平方面的研究尚属空白。
研究内容及结果
1. 使用CRISPR-Cas9基因编辑系统构建miR-26a敲除的HeLa细胞系
作者使用CRISPR-Cas9基因编辑系统构建了miR-26a敲除的HeLa细胞系。作者首先设计了两条single-guide RNAs (sgRNAs)耗尽miR-26a（图1a），并克隆到lentiCRISPRv2载体中，通过DNA测序确认插入载体（图1b）。转染后，通过核苷酸测序也证实了由靶位点中的28-bp缺失引起的突变（图1c）。敲除株系中的miR-26a水平显著低于（降低76％）野生型细胞中的miR-26a水平。
图1 CRISPR-Cas9系统在HeLa细胞中产生miR-26a敲除系
2. miR-26a缺陷细胞表现出明显的细胞生长和增殖
作者发现，与野生型HeLa细胞相比，miR-26a缺陷细胞（敲除株系）表现出明显的细胞生长现象（图2a）。因此，作者又比较了野生型和敲除株系的细胞增殖情况，发现在miR-26a缺陷细胞中观察到更高百分比的细胞停留在G2期（图2b）。Annexin V染色法和流式细胞术确定凋亡程度，发现miR-26a缺陷系中凋亡细胞的百分比显着低于野生型HeLa细胞（图2c）。这些数据表明miR-26a调控细胞生长和增殖的功能，这和已有的报道结果一致。
图2 miR-26a缺陷细胞表现出改变的生长速率和细胞周期
3. SWATH-MS相对定量蛋白质组学
作者选择正常HeLa细胞（NC-Hela）和miR-26a敲除细胞（KO-HeLa），三个生物学重复，进行SWATH-MS定量蛋白质组学的实验。共鉴定到3201种蛋白质，其中差异表达蛋白有466种（p <0.05，foldchange> 1.5），上调蛋白214种，下调蛋白252种（图3a，b）。功能注释发现这些差异蛋白发挥应激反应、增殖、定位、发育、信号传导等方面的功能（图3c，d）。与野生型细胞相比，HSP90在miR-26a敲除系中表达增加76.4％。据报道，HSPs在多种人类癌症中表达上调，其高水平表达可能为癌症发展提供有力环境。下调蛋白如核糖体蛋白（RP）是核糖体组分，其在核糖体生物发生和蛋白质翻译中起作用。有研究指出有几种RP是斑马鱼的癌症基因，此外，在一系列的癌症类型个体中发现RP表达一致失调。这合理地解释了作者在miR-26a缺陷系中某些RP的下调，并显示出肿瘤特征。总而言之，作者的蛋白质组学分析构建了HeLa细胞中miR-26a调节的转录物清单，并为进一步探索miR-26a在人类癌症中的功能提供了基础。
图3 差异蛋白分析
4. miR-26靶向蛋白互作分析
接下来，作者对表达水平显着改变的蛋白质进行了PPI分析（图4），发现在413种蛋白质中鉴定出1950种相互作用。其中DNA拓扑异构酶2-α（TOP2A）显示与63种其他蛋白质的相互作用，代表了相互作用网络中最杰出的蛋白质节点。已有报道指出TOP2A存在于乳腺癌和其他一些癌症中，并与P53存在相互作用，而P53是一种重要的肿瘤抑制因子。TOP2A和其他miR-26a调节的蛋白质的多重相互作用表明TOP2A相关途径在癌发生或抗癌作用中起关键作用。
图4 差异蛋白PPI分析
5. 候选蛋白验证
结合miR-26a敲除株系表现出细胞生长和增殖改变的观察结果，作者选择了几种参与细胞增殖的蛋白质，并通过蛋白质印迹和PRM验证定量结果。结果表明验证蛋白质均显示出一致的表达趋势，如现CDK1、CDK4和CDK6在miR-26a敲除株系中上调，表明它们被miR-26a抑制。CDK1是促进有丝分裂的中枢调节因子，CDK4和CDK6在早期G1期被激活。细胞色素c（CYC）和细胞凋亡调节因子BAX在miR-26a敲除系中被下调，表明它们被miR-26a激活。这些蛋白质在三种实验方法，即SWATH-MS、PRM和WB中显示出相同的表达水平改变趋势，表明SWATH-MS实验定量结果的可靠性。
图5 候选蛋白验证分析
6. 候选靶标序列分析
为了从SWATH蛋白质组学鉴定的候选靶标转录物中发现miR-26a匹配序列，作者对蛋白质组学鉴定的所有基因的转录物进行核苷酸序列检所分析，以获得它们的3'-UTR序列。作者使用PicTar、TargetScan、miRanda和RNA22来预测miR-26a的潜在靶标，然后将其与蛋白质组数据进行比较（图6a）。图6a列出基于蛋白质组学分析在敲除细胞系中高表达且通过上述三种生物信息学预测方法成功预测的miR-26a靶基因。
图6候选靶标序列分析
7. 萤光素酶实验验证miR-26a靶标
作者随后进行了萤光素酶实验以确定miR-26a是否直接调节从SWATH分析中鉴定的候选靶标。作者实验了在3'-UTR区域中的二十四个候选靶标（图6a），其中6个候选靶标即NUF2、CDK6、MYPN、DNAJC9、USP47和PPA1的萤光素酶实验显示出显著降低（p <0.05）（图6b），这六个靶标包含与miR-26a匹配的3'UTR中的种子序列（图7a）。另外，WB结果表明，这些靶标的表达水平在miR-26a过表达体系中下调（图7b）。
图7 验证miR-26a与六种潜在靶标之间相互作用
文章小结
作者基于SWATH的蛋白质组学揭示了潜在的miR-26a靶标，并进一步采用生物信息学方法和萤光素酶实验验证miR-26a与潜在靶标之间的相互作用，且这些潜在靶标在miR-26a过表达株系中表达抑制，表明它们是miR-26a的真正靶标。总之，这项研究首次通过大规模蛋白质组学方法在HeLa细胞中创建了miR-26a靶基因的清单。此外，该研究的发现为进一步探索miR-26a在人类癌症中的功能奠定了一定的基础。
解析文献
Hexiao Shen, Li Li, et al. Label-free Quantitative Analysis of Protein Expression Alterations in miR-26a-Knockout HeLa Cells using SWATH-MS Technology[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1):1399
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