水质对 LC-MS 分析痕量荷尔蒙的重要性
前言
随着分析仪器灵敏度不断提高，超痕量的物质也很容易被检测出来，所以实验人员也越来越重视试剂的纯度。如果用含有痕量杂质的水做LC-MS流动相，或制备标样和空白样品，会导致错误的结果或者数据分析的困难。在很多国家，从环境中（也包括水路）检测出医药产品的存在。饮用水中存在痕量荷尔蒙的报道也越来越多，而这一类化合物很难被传统的水处理方法去除。
这也影响到了LC-MS级别纯水，因为无论瓶装或直接纯化的LC-MS级别水都是由自来水制得。
目的
本文的目的是研究无论自来水有没有被痕量激素污染，制备 LC-MS 级别超纯水的实验室纯水系统的适用性。
样品制备和检测方法样品收集：
自来水：世界上多个国家自来水，包括西班牙、法国、芬兰、中国和印度
超纯水：来自世界多个国家实验室纯水系统制备的LC-MS级别超纯水，包括西班牙、法国、芬兰、中国和印度。
水样在运输及测试过程中必须使用硅酸盐玻璃器皿。
水纯化系统：
- 波兰和印度： Milli-Q Integral with Millipak® final filter (EMD Millipore)
- 法国： Milli-Q® Integral with LC-Pak® final filter
- 中国和西班牙：Elix® and Milli-Q® Advantage with Millipak® final filter
水纯化系统生产的超纯水质量参数：
印度：TOC: 48 ppb, Resistivity: 18.2 MΩ·cm，25C 其他国家：TOC<5ppb, 电阻率18.2 MΩ·cm ，25C 样品前处理：
使用SPE(LiChrolut® EN, EMD Millipore)或Phenomenex Strata® -X（用于西班牙样品）
- SPE活化：5mL 甲醇(LiChrosolv® LC-MS, EMD Millipore)
- 上样：15 mL/min，10 min 真空干燥
- 洗脱：3mL甲醇，蒸发至1mL
材料和方法：
仪器
- LC-MS系统：HPLC：Agilent 1290
- MS：Agilent 6420 QQQ
- HPLC仪器参数：
- 色谱柱：Purospher® STAR RP-18 endcapped (2 μm) Hibar® HR 50-2.1 mm (EMD Millipore)
- 流速：0.5 mL/min
- 进样量：样品40 μL, 标样10 μL
- 溶剂A：含有1%乙酸的Milli-Q®超纯水
- 溶剂B：高纯度乙*(LC-MS LiChrosolv®, EMD Millipore)
- 梯度（min, %B）：
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Time |
A% |
B% |
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0 |
100% |
0 |
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2 |
100% |
0 |
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5 |
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6 |
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9 |
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0 |
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13 |
100% |
0 |
4.MS 参数: Capillary 4000 V, Nebulizer 37 psi, Drying gas N2, 7.5 /min, 300o C; ESI+, MRM
水样品中检测出如下荷尔蒙：
结果与讨论：
从污水处理厂流出的水中检测出低浓度（ng/L）荷尔蒙，这些水被直接排放至水路中，甚至被作为饮用水。如果自来水中存在痕量荷尔蒙，就要在超纯水应用于激素类物质的检测用于制备样品和标样，以及作为LC-MS流动相和空白之前，确保能够被纯水系统除去。
使用标准加入法可以检测时9种不同的荷尔蒙。 荷尔蒙分析的方法检出限（MDL）为12-36 pg/L。
使用LC-MS/MS检测出（IDL）的荷尔蒙浓度（图1、2和3）：
- Estradiol: 法国样品 265.40 ng/L 西班牙样品 297.92 ng/L
- Androsterone: 法国样品 515 ng/L, 西班牙样品1635 ng/L*西班牙样品*( 可能样品中存在荷尔蒙类似物使得检测含量过高)
- Corticosterone: 中国样品 14.91 ng/L
相对应的，在这些水样对应的超纯水样品中并没有检测出荷尔蒙(MDL: 12-36 fg/L, IDL: 0.4-1.1 pg)
结果和讨论：
图1. 法国和西班牙自来水样品中Estradiol 的LC-MS/MS结果（左图）和Milli-Q®纯水结果对比（右图，标样为1ppm的Estradiol）
图2. 法国和西班牙自来水样品中Androsterone 的LC-MS/MS结果（左图）和Milli-Q®纯水结果对比（右图，标样为1ppm的Androsterone）
图3. 法国和西班牙自来水样品中Corticosterone 的LC-MS/MS结果（左图）和Milli-Q®纯水结果对比（右图，标样为1ppm的Corticosterone）
结论
- 自来水中可能含有痕量荷尔蒙。为了满足实验室应用要求，自来水要通过各种纯化手段制备成超纯水。
- 作为水纯化系统的进水中如果可以检测出荷尔蒙（或类似物），在超纯水系统制备的纯水中已检测不出该类物质。
- 为LC-MS/MS实验选择合适的超纯水资源可以确保得到高质量的数据。
- 可以依靠正确的安装和良好的维护纯水系统来满足实验室LC-MS/MS分析对超纯水高质量的要求。