题目：Landscape of submitochondrial protein distribution
期刊：Nature Communications
影响因子：12.353
主要技术：SILAC、线粒体蛋白质组学
研究背景
线粒体是具有双层膜结构包裹的细胞器，对细胞的能量代谢起着至关重要的作用。据估计，酵母和人类分别含有线粒体内的蛋白约1000种和1500种，分布在四个不同的子区室中。目前已有许多对线粒体细胞器蛋白组学的研究，但是对这些蛋白质在细胞器内的局部定位没有明确解析。
研究内容及结果
1. 线粒体蛋白质组学图谱
作者选择酿酒酵母作为研究对象，使用SILAC定量蛋白质组学技术对酿酒酵母线粒体中可溶性蛋白、外周膜蛋白、整合膜蛋白进行鉴定分析（图1a）。并使用两种不同的方法对三类线粒体蛋白进行分类：1. 使用pH11.5的碳酸盐溶液处理，将线粒体分为膜蛋白（沉淀中，PELcarb）和外周膜＋可溶性蛋白（上清中，SNcarb）两个组分；2. 超声处理将线粒体分为膜蛋白（包含内膜和外周膜蛋白，PELson）和可溶性蛋白（SNson）（图1b）。结果共定量1053种不同的蛋白质，其中805种蛋白质属于整合膜、外周膜和可溶性蛋白质。作者通过多元混合正态分布统计分析，从每个类别中挑选已知且经过实验验证的参考蛋白质进行验证，数据集中的线粒体蛋白可分为完整的膜蛋白，可溶性蛋白以及界限模糊的四个蛋白组分（图2a）。WB验证结果表明该分离组分是可行的（图2b），最后作者分别鉴定了321个完整的膜蛋白，258个完整的膜蛋白，226个可溶性蛋白和182个模糊蛋白（图2d）。
图1 线粒体蛋白质组学
图2 线粒体蛋白定位
2. 鉴定新的线粒体蛋白质
在数据集中发现鉴定到206个未被SGD数据库和PROMITO数据库注释的蛋白。为了确定这些蛋白是否属于新的线粒体蛋白或者是来自于未除干净的其他细胞组分，作者比较了它们在线粒体和完整酵母细胞中的相对丰度（比值）（图3a），结合WB实验进行定位，发现比值分为三个区间，<1，1-10，>10。比值小于1则说明，蛋白全部定位在线粒体中，如Sod2、Mdh1和Tom22；比值在1-10之间表明蛋白在线粒体和细胞质中均有分布，如S100和P100；比值大于10 的蛋白则有可能不定位在线粒体中，如Sod1（图3b）。
为了验证比值大于10 这部分蛋白究竟是否会进入线粒体中，作者通过体外转录/翻译合成了放射性标记的前体蛋白，并成功地将标记蛋白质导入到分离线粒体中（图3c）。作者检测了14种不同的前蛋白，这些前蛋白迄今未注释为线粒体蛋白，在数据集表现为可溶性或外周膜或模糊蛋白。根据膜电位Δψ结果显示，所有前蛋白都被导入线粒体（图3d-f），此外，部分蛋白质在运输进入线粒体后还进行了进一步蛋白剪切。总之，作者鉴定了迄今为止未划分到线粒体的206种蛋白质，并且证实了其中14种蛋白的线粒体定位。
图3 验证新蛋白质的线粒体定位
3. 整合线粒体蛋白质分布图
为了进一步完善线粒体蛋白质分布全景图，作者将上述鉴定的整合膜蛋白分别分配到外膜（OM）和内膜（IM）。此外，作者作者使用公认的OM和膜间隙（IMS）参考蛋白质组推导所有线粒体蛋白质的亚定位。总而言之，酵母线粒体蛋白分布全景包括236个外周和245个整合的IM蛋白，21个外周和74个整合的OM蛋白，49个IMS和193个可溶性基质蛋白（图4）。
文章小结
作者首次将线粒体蛋白细分成外膜、膜间质、内膜和基质四个不同组分，结合SILAC定量蛋白质组学技术将818种线粒体蛋白质定位在对应的亚区。此外本文不仅对蛋白在线粒体中的亚定位进行重新区分验证，并且发现了206个新的线粒体蛋白，提供其在细胞器内特定定位的详细图谱。
解析文献
F.-Nora Vögtle, Julia M. Burkhart, et al. Landscape of submitochondrial protein distribution [J]. Nature Communications, 2017, 8:290.