涨知识 | 克隆专题五：分子克隆转化方法
克隆技术，又称为“生物放大技术”，目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。
大部分的分子克隆方法，诸如传统分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、无缝克隆等都绕不开目的片段制备、载体制备、连接、转化、筛选等等步骤。其中，转化是分子克隆的关键步骤，其目的是产生重组DNA质粒的多个拷贝。接下来小翌就具体解析一下重组质粒转化至宿主细胞的过程，为您的实验提供好方法。
转化是细菌细胞低频率吸收外界DNA的自然过程，在分子生物学实验中，用于在专门为吸收DNA而制备的“感受态”细菌内增殖质粒。在转化过程中，质粒DNA被引入到适当的菌株中，以便菌株可以复制目标序列，用于后续进一步的分析或操作。转化通常包括化学转化法和电转化法。
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化学转化法（CaCl2）
化学转化是分子克隆实验中最成熟、最常用的方法。该方法在1970年由Mandel和Hige发现，研究表明大肠杆菌细胞经CaCl2溶液处理时能够吸收λ噬菌体DNA。原理是利用理化方法诱导细胞，改变细胞膜状态，增强细胞膜的通透性，细胞膜表面性状发生暂时性改变，方便外源基因或者载体进入受体细胞，这种处于最适摄取和容纳外来DNA状态的细胞称为感受态细胞（competent cell）。感受态细胞是基因克隆和蛋白表达所必备的工具。市面上就能提供可实现高效、可靠转染的感受态细胞。
其核心步骤主要分为三步
①质粒DNA进入细胞；
②细胞恢复；
③细胞接种培养。
可根据下游应用的不同，选择不同的感受态细胞，如表1所示，常见的有翌圣DH5α化学感受态（Cat#11802ES）、TOP10化学感受态（Cat#11801ES）、BL21(DE3)化学感受态（Cat#11804ES）、根癌农杆菌感受态等。
表1.感受态菌株的选择
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菌株 |
特点 |
用途 |
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DH5α |
一种常用于质粒克隆的菌株。缺失核酸内切酶（endA），提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型（recA）减少插入片段的同源重组率，保证了插入DNA的稳定性；lacZΔM15的存在使得DH5α可用于蓝白斑筛选。 |
构建克隆， 质粒提取， 蓝白斑筛选 |
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TOP10 |
TOP10生长速度快（比DH5α快），10小时可见克隆，recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 |
构建克隆， 质粒提取， 蓝白斑筛选 |
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BL21(DE3) |
用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效蛋白表达宿主，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX、pMAL等质粒的蛋白表达。 |
非毒性蛋白的表达 |
翌圣利用改良的生产菌株，采用严格的生产工艺，制备了高效、稳定、适用性广的高效感受态细胞，其批次间稳定性强，转化效率高（＞108 cfu/μg），无杂菌污染，无抗性偏好。广泛适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传，适用于蓝白斑筛选。
为了加快感受态转化的流程，市面上也有应运而生的快速感受态，如翌圣F DH5α化学感受态（Cat#11803ES），与传统的感受态相比，转化效率高，转化时间短，仅需10 min就能完成转化过程，省去了热激、复苏等步骤，更加高效快速。
02
电击法
电击法是通过电脉冲迅速打开细胞膜上按触外界的通道，引导外源基因转入细胞中，即通过施加电流来改变物质化学性质的方法。将待转化的DNA溶解于受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。电击法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。电击法的优势是操作简单，成本低廉，没有基因毒性，但需要电击杯、电转仪器，且存在转化效率低的问题。 除了通用的转化法，质粒DNA还能通过其他方法转化至细胞中，包括PEG法转化、根癌农杆菌介导法等。
03
PEG介导法
PEG介导法为高国楠首创，该方法是通过PEG（细胞融合剂）将外源基因转入原生质体中。PEG（Cat#60304ES）作为细胞融合剂，可通过引起细胞膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞间融合和外源DNA分子进入原生质体。碳酸钙可与DNA结合形成DNA-碳酸钙复合物而被原生质体摄入。PEG法的优势在于其操作简单，但存在原生质体制备限制、转化效率低的问题。
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根癌农杆菌介导法
根癌农杆菌介导法（ATMT）是通过根癌农杆菌侵染细胞，将其携带的T DNA质粒插入细胞中。研宄表明根癌农杆菌的转化效率受到启动子、受体材料、根癌农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间等因素的影响。转化技术往往对仪器设备要求高，操作复杂，转化效率低。根癌农杆菌介导法具有可选择的受体材料范围广，对仪器设备要求低，转化效率高，操作简单等特点。翌圣乙酰丁香酮（Cat#60326ES）能诱导根癌农杆菌Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒携带的VirA基因的活化和高效表达，从而启动其他Vir基因表达，切割下质粒上的一段T-DNA单链，促进其转化和整合入寄主植物基因组内。目前普遍应用于农杆菌介导的遗传转化研究中。 通过转化反应，重组DNA质粒已转化至宿主细胞中，接下来就来到了分子克隆的最后一步——阳性转化子的筛选。即把要转化的细胞置于含有适量抗生素的琼脂板上，通过蓝白斑或其它方法筛选含有所需质粒及插入片段的菌落。那么筛选步骤中应用到的技术和试剂又有哪些呢？关注我们，小翌会在下一期的分子克隆技术专题中给大家具体讲解筛选技术，为您的实验带来新的思路与方向，期待下一次的见面~
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相关产品列表
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产品定位 |
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
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快速感受态细胞 |
DH5α Fast Chemically Competent Cell F DH5α化学感受态 |
10×100 μL |
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常规感受态细胞 |
TOP10 Chemically Competent Cell TOP10化学感受态细胞 |
10×100 μL |
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常规感受态细胞 |
DH5α Chemically Competent Cell DH5α 化学感受态细胞 |
10×100 μL |
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常规感受态细胞 |
BL21(DE3) Chemically Competent Cell BL21(DE3)化学感受态细胞 |
10×100 μL |